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為嚴(yán)格遵循藥品微生物檢驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范，保障公司各品類藥品微生物限度檢驗(yàn)工作的科學(xué)性、規(guī)范性與準(zhǔn)確性，有效規(guī)避樣品抑菌干擾、操作不規(guī)范、系統(tǒng)誤差等問(wèn)題，確保檢驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠、可追溯，特制定本微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案。本方案為公司通用標(biāo)準(zhǔn)方案，適用于企業(yè)所有藥品品種的細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)以及控制菌檢查的方法驗(yàn)證與適用性確認(rèn)工作，同時(shí)可作為日常檢驗(yàn)方法合規(guī)性核查、方法變更再驗(yàn)證的依據(jù)。
一、崗位職責(zé)劃分
為保障驗(yàn)證工作權(quán)責(zé)清晰、流程閉環(huán)，明確各崗位人員工作職責(zé)，所有參與驗(yàn)證的崗位人員嚴(yán)格按照以下職責(zé)開展工作：項(xiàng)目責(zé)任人主要負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的編制起草、試驗(yàn)流程規(guī)劃及驗(yàn)證全過(guò)程的具體實(shí)施；驗(yàn)證管理員專職負(fù)責(zé)驗(yàn)證工作的整體組織、跨崗位協(xié)調(diào)、進(jìn)度管控及全程管理；QA現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控員對(duì)驗(yàn)證實(shí)施全過(guò)程進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)督、全程巡檢、現(xiàn)場(chǎng)取樣核查，杜絕違規(guī)操作，確保試驗(yàn)過(guò)程合規(guī)、結(jié)果真實(shí)可靠；QC負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)審核驗(yàn)證方案中的檢驗(yàn)技術(shù)方法，嚴(yán)格落實(shí)取樣計(jì)劃，監(jiān)督標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的精準(zhǔn)執(zhí)行，統(tǒng)籌組織整體驗(yàn)證試驗(yàn)實(shí)施；QC檢驗(yàn)員參與方案研討起草，全程參與各項(xiàng)驗(yàn)證試驗(yàn)操作，精準(zhǔn)記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)的真實(shí)性、準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)；質(zhì)量部經(jīng)理負(fù)責(zé)最終審核、批復(fù)驗(yàn)證方案及驗(yàn)證總結(jié)報(bào)告，對(duì)驗(yàn)證結(jié)果合規(guī)性終審把關(guān)。
二、方案驗(yàn)證目的
本方案核心驗(yàn)證目的為驗(yàn)證公司現(xiàn)有藥品微生物限度檢驗(yàn)方法的適用性、準(zhǔn)確性與專屬性。通過(guò)全套標(biāo)準(zhǔn)化驗(yàn)證試驗(yàn)，確認(rèn)當(dāng)前檢驗(yàn)方法能夠精準(zhǔn)適配各品種藥品特性，可有效完成藥品細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)，同時(shí)滿足各類藥品控制菌的專項(xiàng)篩查檢查要求。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品日常微生物限度檢測(cè)同步開展，提升工作效率。若驗(yàn)證結(jié)果符合既定標(biāo)準(zhǔn)，即可將該套檢驗(yàn)方法作為本品種常規(guī)檢測(cè)方法常態(tài)化使用；若驗(yàn)證結(jié)果不達(dá)標(biāo)，需針對(duì)性優(yōu)化供試液制備方式、抑菌消除手段及檢驗(yàn)試驗(yàn)條件，重新開展驗(yàn)證試驗(yàn)，直至驗(yàn)證結(jié)果完全符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。
三、菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證
1. 試驗(yàn)菌株要求
依據(jù)藥典及企業(yè)檢驗(yàn)規(guī)范，本次計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證選用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株，菌株來(lái)源為官方標(biāo)準(zhǔn)菌種庫(kù)，性能穩(wěn)定、溯源清晰。其中，細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證菌株包含：大腸埃希菌【CMCC（B）44102】、金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】；霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證菌株包含：黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。所有試驗(yàn)菌株嚴(yán)格管控傳代次數(shù)，從菌種中心獲取的凍干菌種為0代，試驗(yàn)使用菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代，全程采用規(guī)范菌種保藏技術(shù)，維持菌株原有生物學(xué)特性，杜絕菌種變異影響試驗(yàn)結(jié)果。
2. 菌液與供試液制備
嚴(yán)格按照菌株特性開展培養(yǎng)及菌液制備：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35～37℃恒溫培養(yǎng)18～24h；白色念珠菌接種于改良馬丁培養(yǎng)基，23～28℃培養(yǎng)24～48h；黑曲霉接種于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，23～28℃培養(yǎng)5～7d。培養(yǎng)完成后采用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液進(jìn)行10倍遞增梯度稀釋，最終制備濃度為50～100CFU/mL的菌懸液或孢子懸液，用于后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)。
本方案統(tǒng)一采用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為試驗(yàn)稀釋劑。無(wú)抑菌活性的普通供試品統(tǒng)一按照1:10比例制備供試液：液體供試品取10mL，加入90mL稀釋劑混勻；固體、半固體及粘稠性供試品取10g，加稀釋劑定容至100mL混勻。對(duì)于含有抑菌成分、存在抑菌活性的特殊供試品，需提前消除抑菌干擾，可單獨(dú)或聯(lián)合使用培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過(guò)濾法、離心沉淀集菌法、中和法，根據(jù)藥品成分特性選用對(duì)應(yīng)中和劑，徹底消除抑菌作用，保障微生物可正常檢出。
3. 試驗(yàn)分組與結(jié)果判定
為排除試驗(yàn)干擾、精準(zhǔn)核算方法回收率，本次驗(yàn)證共設(shè)置四組試驗(yàn)體系，分別為菌液組、試驗(yàn)組、供試品對(duì)照組、稀釋劑對(duì)照組。菌液組用于測(cè)定試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌的基礎(chǔ)菌落數(shù)；試驗(yàn)組為供試液與試驗(yàn)菌同步試驗(yàn)體系；供試品對(duì)照組用于檢測(cè)供試品本身本底微生物，扣除樣品自帶菌干擾；稀釋劑對(duì)照組用于驗(yàn)證稀釋劑及試驗(yàn)處理流程無(wú)抑菌影響。試驗(yàn)可根據(jù)樣品特性選用平皿法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過(guò)濾法、離心集菌法開展檢測(cè)，所有菌株試驗(yàn)均需平行開展3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，保證數(shù)據(jù)客觀有效。
試驗(yàn)核心判定指標(biāo)為菌回收率，計(jì)算公式嚴(yán)格遵循檢驗(yàn)規(guī)范，分別核算試驗(yàn)組及稀釋劑對(duì)照組回收率。統(tǒng)一合格標(biāo)準(zhǔn)：稀釋劑對(duì)照組菌回收率≥70%，試驗(yàn)組菌回收率≥70%。三次獨(dú)立試驗(yàn)均達(dá)標(biāo)，可確認(rèn)該供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法適用于該藥品微生物計(jì)數(shù)檢測(cè)；若任意一次試驗(yàn)回收率不達(dá)標(biāo)，判定方法存在缺陷，需優(yōu)化抑菌消除方案，重新開展全套驗(yàn)證試驗(yàn)，直至回收率滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。
四、控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證
1. 驗(yàn)證菌株
控制菌驗(yàn)證選用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株，包含大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌，所有菌株均為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌種，性能等效合規(guī)。菌株管理嚴(yán)格執(zhí)行傳代及保藏規(guī)范，傳代次數(shù)不超過(guò)5代，全程保障菌株活性與特異性，確�？刂凭Y查試驗(yàn)的準(zhǔn)確性與專屬性。
2. 試驗(yàn)規(guī)范
將各試驗(yàn)菌株新鮮培養(yǎng)物接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，35～37℃培養(yǎng)18～24h，經(jīng)無(wú)菌氯化鈉溶液梯度稀釋后，制備濃度為10～100CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液。為驗(yàn)證檢測(cè)方法專屬性，試驗(yàn)需設(shè)置陰性菌對(duì)照組，不同控制菌檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)應(yīng)專屬陰性對(duì)照菌，陰性對(duì)照菌全程不得檢出，以此排除方法非特異性干擾。針對(duì)不同抑菌特性的供試品，可靈活選用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過(guò)濾法、離心集菌法、中和法開展試驗(yàn)，適配不同樣品的檢測(cè)需求。
3. 結(jié)果判定
控制菌驗(yàn)證需完成3次獨(dú)立平行試驗(yàn)，試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)明確：陰性菌對(duì)照組無(wú)對(duì)應(yīng)菌株檢出，證明方法專屬性合格；試驗(yàn)組可正常檢出對(duì)應(yīng)的目標(biāo)試驗(yàn)菌，說(shuō)明該檢驗(yàn)方法可有效檢出樣品中的控制菌，方法適用。若試驗(yàn)組未檢出目標(biāo)菌，說(shuō)明供試品抑菌作用未完全消除或檢測(cè)方法存在缺陷，需優(yōu)化樣品處理工藝和檢驗(yàn)方案，重新開展驗(yàn)證工作，直至試驗(yàn)結(jié)果達(dá)標(biāo)。
五、實(shí)施與管理要求
所有驗(yàn)證試驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)記錄、試驗(yàn)現(xiàn)象均需全程如實(shí)記錄，填寫配套的計(jì)數(shù)方法及控制菌方法驗(yàn)證記錄表，保證數(shù)據(jù)完整、過(guò)程可追溯。試驗(yàn)完成后匯總?cè)吭囼?yàn)數(shù)據(jù)，梳理試驗(yàn)過(guò)程，綜合分析判定檢驗(yàn)方法適用性，形成完整驗(yàn)證結(jié)論。驗(yàn)證實(shí)施過(guò)程中若出現(xiàn)數(shù)據(jù)異常、操作偏差、結(jié)果偏離標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題，嚴(yán)格按照公司《偏差處理程序》開展調(diào)查、處置與復(fù)盤。同時(shí)建立常態(tài)化再驗(yàn)證機(jī)制，當(dāng)藥品配方組分、生產(chǎn)工藝、檢驗(yàn)條件發(fā)生變更，可能影響微生物檢測(cè)結(jié)果時(shí)，必須重新開展方法再驗(yàn)證，持續(xù)保障檢驗(yàn)方法的適用性與合規(guī)性。
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